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理性阐述qPCR实验的Ct值的合理范围。(附Ct值过大或过小的解决方法)

上海翊圣生物科技有限公司2017年12月18日 14:40 点击:194

理性阐述qPCR实验的Ct值的合理范围。(附Ct值过大或过小的解决方法) Ct值是什么?Ct值具有什么样的作用?Ct值的正常范围是多少?Ct值太大或者太小的原因? Ct值是荧光定量PCR最重要的结果呈现形式。它被用于计算基因表达量差异或者基因拷贝数。那么荧光定量的Ct值多大可被认为是合理?如何保证Ct值的有效范围呢?今天就让小编来为大家解答这个问题。Ct值是什么?qPCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数(Cycle Threshold)。C代表CycleT代表Threshold。简单讲,Ct值就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时,所对应的循环数。所谓“一定产物量”后续作进一步解释。Ct值有什么作用?1.指数扩增、模板量与Ct值的关系理想情况下,qPCR中的基因经过一定的循环数被指数扩增而积累,扩增循环数和产物量之间的关系是:扩增产物量=起始模板量×(1+En)循环个数。然而qPCR反应并不是一直处于理想情况下,当扩增产物量达到“一定产物量”时,此时循环个数为Ct值,处于指数扩增时期。Ct值与起始模板量的关系:模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始模板量浓度越高,Ct值越小;起始模板量浓度越低,Ct值越大。 2.扩增曲线、荧光阈值与一定产物量qPCR扩增产物量是以荧光信号的形式直接呈现,也就是扩增曲线。在PCR早期,扩增处于理想情况下,循环数较少,产物积累少,产生荧光的水平不能与荧光本底背景明显地区别,之后荧光的产生增加进入指数期。可以在PCR反应刚处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量,以此作为“一定产物量”,并且由此来推断模板最初的含量。因此,一定产物量对应的荧光信号强度,也就是荧光阈值。PCR的后期,扩增曲线不再呈现指数扩增,进入线性期和平台期。 3.Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期,此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。Ct值的范围?1.扩增效率EnPCR扩增效率是指聚合酶把待扩增基因转变生成扩增子的效率。由1DNA分子转变生成2DNA分子时的扩增效率为100%。扩增效率常用En表示。为了方便后续文章的分析,简要介绍下影响扩增效率的因素。
影响因素解释如何判定?
A.PCR抑制剂1.模板RNA中可能含有抑制PCR反应的物质,如蛋白质或去污剂等。2.反转录后的cDNA中含有高浓度的模板RNA和反转录试剂成分,也可能对后续PCR存在抑制。1.可通过测定A260/A280A260/A230比值或RNA电泳,判断是否存在污染。2.反转录后cDNA是否按照一定比例进行稀释。
B.引物设计不合理引物不能有效退火检查引物是否存在二聚体或发夹结构、存在错配;有时需注意跨内含子设计。
C.反应程序不合适1.引物不能有效退火。2.DNA聚合酶活性未充分释放,3.长期高温,DNA聚合酶活性下降。1.退火温度高于引物Tm值。2.预变性时间太短。3.反应程序各阶段时间过长。
D.试剂未充分混匀或移液误差反应体系中,PCR反应成分的局部浓度过高或不均匀,导致PCR扩增不呈指数扩增。 
E.扩增子长度扩增子长度太长,超过300bp,扩增效率低。检查扩增子长度是否在80bp-300bp之间。
F.qPCR试剂的影响试剂中DNA聚合酶浓度较低或Buffer中离子浓度非最优化,导致Taq酶活力未达最强。标准曲线测定引物扩增效率。
 2.Ct值的范围Ct值的范围为15-35Ct值小于15,认为扩增在基线期范围内,未达到荧光阈值。理想情况下,Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系,也就是标准曲线。通过标准曲线,扩增效率为100%时,计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右,若大于35,理论上模板起始拷贝数小于1,可认为无意义。对于不同的基因Ct范围,因起始模板量中基因拷贝数和扩增效率不同,需做出该基因的标准曲线,计算出基因的线性检测范围。 3.Ct值的影响因素由扩增循环数和产物量之间的关系:扩增产物量=起始模板量×(1+En)循环个数,可以看出,在理想条件下,起始模板量和En会对Ct值产生影响。模板质量或者扩增效率的差异会造成Ct值偏大或过小。 4.Ct值过大或过小小翊威逼利诱了我公司技术部的牛牛们,总结出Ct值常见的两类问题的原因和解决方法,以飨读者。
问题可能的原因解决方法
Ct值过大1.模板浓度低或存在PCR抑制物2.扩增效率低1.提高模板浓度;或提高RNAcDNA稀释比例;或重新制备模板。2.降低退火温度,或选用二步法扩增;组分和体系充分混匀;优化反应程序;或尝试更换试剂。
Ct值过小1.模板浓度高2.NTCNRC存在污染3.引物设计不合适1.减少模板RNA量;或更高比例稀释cDNA2.重新更换所有试剂;或使用UDGase防污染试剂。3.优化程序,避免非特性扩增。
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(来源: 上海翊圣生物科技有限公司


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