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分子酶专栏之DNA聚合酶(一)

上海翊圣生物科技有限公司2018年6月11日 2:10 点击:187

分子酶专栏之DNA聚合酶(一) 当下,以DNA聚合酶为基础的众多生物技术手段不仅成为基础研究的必备之选,同时也服务于医学诊断领域。DNA聚合酶最广为人知的应用主要有两大块,分别是PCR扩增和DNA测序。在过去的60年里,新型DNA聚合酶的不断发现和改造,赋予了它如今的广泛应用。当然,对于DNA聚合酶的研究永远没有止境,因为人类的不满足,会驱使他不断地寻找更好的酶来应用于更苛刻的PCR和测序需求,或者是一些还未被发明的应用。 在开始我们故事之前,我们照例先来科普一些DNA聚合酶的基础知识。虽然DNA聚合酶的种类很多,但是他们在结构类型上,都有一些基本的结构域。主要包含掌域、手指域和拇指域,其中手指域掌管dNTP的结合,掌域控制催化dNTP的掺入、拇指域与DNA的持续合成能力有关(图1)。图1. DNA聚合酶的结构模型 目前根据序列的相似性,DNA聚合酶可被分成7个不同的亚家族:A、B、C、D、E、F和RT(表1)。而决定DNA聚合酶不同功能的最主要因素是由拇指与手指域的结构(图2),如同属于A家族DNA聚合酶的Taq DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶和Bst聚合酶在耐热性、链置换能力上还有很大的不同。此外一些附加的结构域提供了额外的功能,如3’-5’端外切酶和5’-3’端外切酶活性。表1. DNA聚合酶家族分类表 
FamilyTypes   of DNA polymeraseSpeciesExamples
AReplicative   and Repair PolymerasesEukaryotic   and ProkaryoticT7 DNA   polymerase, Pol I, and DNA Polymerase γ
BReplicative   and Repair PolymerasesEukaryotic   and ProkaryoticPol   II, Pol B, Pol ζ, Pol α, δ, and ε
CReplicative   PolymerasesProkaryoticPol   III
DReplicative   PolymerasesEuryarchaeotaNot   well-characterized
XReplicative   and Repair PolymerasesEukaryoticPol β,   Pol σ, Pol λ, Pol μ, and Terminal deoxynucleotidyl   transferase
YReplicative   and Repair PolymerasesEukaryotic   and ProkaryoticPol ι   (iota), Pol κ (kappa), Pol η (eta),Pol IV, and Pol V
RTReplicative   and Repair PolymerasesViruses, Retroviruses,   and EukaryoticTelomerase,   Hepatitis B virus
 12图2. 生物技术应用中常见的DNA聚合酶的三维晶体结构图。 如何综合而全面地评价DNA聚合酶的性能?这确实是一个不好回答的问题。根据小编博采众长之后,认为以下指标能够比较全面地概括:热稳定性、延伸速率、持续扩增能力、保真性、特异性、模板损伤耐受性、抑制物抗干扰能力、链置换能力强、核酸酶活性和非天然核苷酸掺入能力。 对于不同的DNA聚合酶的应用,野生型的蛋白显然无法满足需求。此时就需要最聚合酶进行定向进化(directed evolution),常见的策略包括合理的定点突变、融合表达、噬菌体展示筛选以及compartmentalized self-replication(不太好翻译)。 基于DNA聚合酶的重要性,接下来分多个篇幅来讲述目前DNA聚合酶的发展与应用,希望各位看官能够或多或少得到一些有用的信息。
(来源: 上海翊圣生物科技有限公司


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